神经系统发育异常指在胚胎发育时期人脑结构和功能出现异常，甚至导致流产、先天畸形等难以处理的后果的疾病。人类神经系统的发育是一个很复杂且高度协调的过程，由于人脑组织难以获取且具有种属独特性，难以对人脑进行深入研究，尤其是胚胎时期人脑组织的细胞类型和中枢神经系统各区域间的动态相互作用。3D人脑类器官及类组装体技术为研究人脑科学提供了动态人源性体系。本文将综述人脑类器官及类组装体的发展历史，并介绍它们在多种神经系统发育异常中的发展前途与展望。
人脑具有精密复杂的结构，对学习、认知和运动等发挥着至关重要的作用，而大脑结构或功能异常则会导致严重的神经和精神疾病。随着神经科学的逐步发展，研究人员发现许多神经和精神疾病的根源在于早期神经发育异常，许多神经精神疾病的病理异常也起源于发育过程。基于模式动物的研究促进了人们对神经发育、神经回路形成和特定基因突变疾病进程的认识，并且在将来的脑科学研究中依旧无法替代。动物模型与人类的种属差异使得人脑的尺寸和复杂程度、发育及神经系统疾病的特异性无法在动物模型中重现，这也是目前许多药物临床试验失败的主要原因。
人脑组织的获取途径有限，加上其独有的结构和遗传背景，深入探讨诸多脑部疾病的神经发育病因及发病机制仍具有挑战性。人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC），包括人胚胎干细胞（human embryonic pluripotent stem cell，hESC）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC），具有体外分化为任意类型细胞和组织的潜能，研究人员可在体外待其分化为特定类型神经元及神经胶质细胞后，在人源性模型下研究人脑发育、神经发生和神经系统疾病的发生发展等。但这种2D培养模式无法体现三维（3D）组织中细胞间乃至器官间的相互作用，也限制了对神经系统疾病的深入研究，因此亟须可模拟人脑复杂结构的3D模型。
为了解决这样一些问题，源自hPSC分化而来的3D人脑类器官技术为建立人类特异性模型及研究与人类相关遗传变异疾病开辟了新道路。人脑类器官是hPSC衍生的自组织3D结构，它模拟了发育中胎儿大脑的各种结构与功能特征，并且呈现出与胎儿发育时间相似的神经发育轨迹。基于人脑类器官技术，由多个类器官整合或类器官与其他细胞类型组合形成的类组装体技术，为研究神经系统中不同谱系细胞间及不同脑区间的相互作用提供了良好平台。
中枢神经系统从神经管发育而来，而神经管是由神经板折叠和融合形成的结构，这一发育过程又受到沿神经管背-腹轴和前-后轴梯度中形态发生因子的调控。依据这一特征，研究人员利用相关发育模式过程的信号分子来指导hPSC的体外分化，能够获得对应脑区的主要神经细胞类型，并对相应的神经和疾病发生过程进行探究。
2001年Su-Chun Zhang等人将hESC体外分化为人源性神经元的过程中，经历了神经玫瑰花环样结构的阶段，即具有极性的人源性神经管的形成，这也是人脑类器官的雏形。2008年Sasai等人在无血清培养体系中得到了具有顶端-基底极性的皮层样结构——拟胚体（embryonic body，EB），进一步奠定了3D脑类器官技术发展的基础。基于这些研究基础，2013年Lancaster等人于Matrigel里嵌入EB，在添加神经发育的生长因子后，获得了更复杂的细胞组成结构，并首次正式提出使用hPSC分化出的3D人脑类器官概念。随后，模拟皮层六层结构的皮层类器官的生成，进一步证明了体外分化的皮层类器官可以模拟人类皮层的结构、发育和功能。
同时多个课题组也对大脑其他不同脑区进行了探索。通过优化皮层类器官分化方案，研究者相继建立了海马类器官、中脑类器官、小脑类器官、丘脑类器官及纹状体类器官等。同时也对神经系统发挥及其重要的作用却难以剖析的神经核团进行了努力探索，成功获得了下丘脑弓状核类器官，这是首个体外分化的人脑精细核团类器官。
总之，人脑类器官的建立可以从细胞层面乃至组织器官层面为研究神经发生、人脑发育及模拟神经系统疾病提供优势人源性模型。同时，多种脑区特异性类器官的相继完善，也为接下来的多谱系类组装体技术奠定扎实基础。
脑区特异性类器官包含多样的不同时间段的细胞类型，如果细胞类型单一，缺乏来自不同脑区其他谱系细胞，则难以模拟真实人脑中神经细胞的相互作用。因此，在脑区特异性类器官技术基础上，类组装体应运而生。它通过结合多个大脑区域或多个不同细胞谱系来概括区域间或细胞间的相互作用，并进一步模拟神经回路的发生，可用于模拟更复杂的神经发育过程，更好地反映神经系统疾病的细微功能异常。
人脑类组装体起先聚焦于细胞迁移。在胎儿神经发育过程中，腹侧前脑的中间神经元会通过切向和径向迁移整合入背侧皮层，过程中若出现异常则会导致自闭症、精神分裂症及智力障碍等多种神经精神疾病的发生。2017年，Birey等人率先通过融合背侧和腹侧前脑类器官构建类组装体，并发现腹侧前脑类器官中的γ-氨基丁酸能神经元能自发迁移至背侧前脑类器官。其他研究小组也通过类似的工作，进一步验证了类组装体在反映细胞间相互作用的潜力。
除了上述迁移的中间神经元，能够将轴突延伸至附近乃至远端脑区的投射神经元也是大脑中不可忽略的一部分，最终可形成成熟的神经回路。目前对神经回路的研究主要基于模式动物，因人源性模型缺乏对人脑中神经投射途径的探索，且内在发生机制尚不清楚。利用类组装体技术，研究者相继建立了皮质-丘脑类组装体、皮质-纹状体类组装体等模拟远程轴突连接，提示类组装体可用于探索人脑神经投射与环路形成。
随着对神经系统的深入研究，研究人员发现，神经细胞与非神经细胞的相互作用在神经发育和疾病中发挥着同样及其重要的作用。为了更准确地模拟发育中人脑组成多样性及功能特异性，研究者引入非神经细胞，并构建了下丘脑-垂体类组装体、皮质-脊髓-肌肉类组装体等。广义的多谱系类组装体还包括在不同人脑类器官中加入非外胚层细胞类型，如加入人脐内皮细胞以促进类器官的血管化，与小胶质细胞共培养以研究阿尔茨海默病中神经-胶质细胞相互作用，与肠道类器官整合后重现脑-肠轴的部分特征等。
类组装体技术的加快速度进行发展为更好阐述人脑发育和模拟大脑中的神经回路提供了可操作研究平台，也为人类深入探索神经系统疾病提供了机会，以及药物、临床治疗建立了潜在的模型基础。
神经系统发育异常包括神经管发育过程中由于闭合失败所导致的脑畸形或脊柱裂，神经发生异常或基因突变导致的诸多神经系统疾病。由hPSC诱导的3D人脑类器官及类组装体技术的加快速度进行发展，为研究者探究神经系统胚胎发育的生理及病理机制提供了新视角。
神经管缺陷（neural tube defects，NTDs）是在早期胚胎发生过程中因神经管闭合失败导致的严重先天性出生缺陷。NTDs 的发病机制很复杂，包括诸多遗传因素和外因，即使经过数十年研究仍未完全了解。由于研究人类胚胎发育时神经管的体内形成在伦理上是不可能的，研究者缺乏合适的模型对神经管闭合过程进行深入探究，这也是NTDs研究面临的巨大挑战。源于hPSC的3D人脑类器官为研究人员提供了体外探索组织分化及神经管动态发育过程的模型。用于研究人类神经管发育和发病的人脑类器官模型也被称为神经管类器官。研究人员首先发现在体外培养过程中，神经管类器官能够模仿体内神经管发生中的极性特征、背-腹轴、前-后轴等。生物芯片及微流控设备的使用，使得神经管类器官的发生更加完整，单细胞测序方法又进一步证实了这些类器官遵循与胚胎相似的逐步基因调控。
虽然神经管类器官的培育尚需更多条件摸索加以完善，但已被证明其可用于探究NTDs的发病机制。Carine Bonnard等人通过源自无脑胎儿患者iPSC分化的脑类器官，证实NUAK2突变会导致人类胎儿神经管发育缺陷，并提出NUAK2有害突变后，Hippo-YAP信号不足，肌球蛋白收缩异常，新生神经管无法正常折叠，从而阻止大脑正常发育，导致无脑畸形发生。
除了遗传因素外，药物使用在内的别的环境因素也是NTDs的致病原因。比如孕期服用治疗癫痫/偏头痛药物丙戊酸钠（valproic acid，VPA），发育中的胎儿会出现不同程度的先天缺陷，包括脊柱裂、小头畸形、认知障碍和自闭症等。Muriel Rhinn等人发现VPA处理后人脑类器官的神经上皮细胞明显衰老，影响皮质生成，导致神经分化受损，提出与VPA暴露下的小头畸形表型有关。
此外，Ju-Hyun Lee等人成功在体外分化的人类脊髓样类器官中观察到了类似体内早期神经管的形态发生过程，包括神经沟形成和神经管闭合。然而目前关于神经管闭合这一过程所需要的生物力学过程及关键驱动力尚不明确。
类器官模型的体外分化方式使其具有易操作性和可重复性，结合表型和基因表达差异可以对NTDs的发病机制做多元化的分析，也更易测试NTDs的药物/基因治疗，这将对于神经系统先天性缺陷机制研究和药物早期测试起重要作用。
神经发育障碍（neuro development disorders, NDDs）是由于神经发育过程被破坏引起的一类影响大脑发育和功能的疾病，具有广泛的遗传和变异性。NDDs包括自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）、注意力缺陷多动障碍、智力障碍等。NDDs的临床表型众多，组内疾病间的合并症发生率高，例如ASD患者和智力障碍患者经常表现出广泛的皮质发育异常。确定不同NDDs的共同致病机制有助于解释这些合并症，建立有效的治疗方案。动物模型不能完全概括人类临床和（或）分子、细胞表型，具备人类基因组的人脑类器官及类组装体将为NDDs的发病机制提供优势模型。
在众多NDDs中，ASD最常见，异质性也最高，有800多个相关基因。对其单基因综合征研究比较深入的包括FMR1突变的脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）、MECP2突变的雷特综合征等。Kang等人利用FMRP基因缺失患者来源的iPSC构建了FXS人脑类器官，其单细胞转录组结果为FXS人脑类器官大量表达改变的基因中，只有少数在FXS小鼠大脑中差异表达。通过抑制PI3K通路能挽救FXS人脑类器官神经发育和突触形成缺陷，这给未来的治疗策略提供了一个有希望的目标靶点。
Jorge Urresti等人利用患有大头畸形或小头畸形的ASD患者的iPSC构建了皮质类器官，对因16p11.2位点的罕见缺失和重复造成的ASD疾病表型进行了机制解析。他们发现患者脑类器官均表现出早期皮质发育障碍，并首次提出16p11.2位点缺失的脑类器官表现为神经元成熟加速，而16p11.2位点缺失和重复则均会导致神经元迁移受损这一新机制。这一研究表明人脑类器官能够在研究不同NDDs的共同疾病表型及可能的共同发病机制中具有人源性模型的独特优势。
人脑类器官除了用于研究不同NDDs外，随后发展起来的类组装体也逐渐显现出它的及其重要的作用。蒂莫西综合征（Timothy syndrome，TS）是一种以ASD和癫痫为特征的严重NDDs，Birey等人利用CACNA1C突变的TS患者来源的iPSC构建了人脑背-腹侧类组装体模型，发现TS患者的皮质中间神经元迁移更频繁但效率更低，而这种异常的神经元迁移能够最终靠尼莫地平得以挽救。
这些研究显示出人脑类器官及类组装体都能准确模拟人类神经系统疾病表型，揭示早期神经发育障碍，进而有助于个性化疾病干预及药物种类和浓度筛选。
人脑类器官及类组装体技术在近几年取得了巨大突破，其在神经系统发育障碍中的应用前景包括以下三点：
（1）模拟NTDs和NDDs在内的多种神经系统疾病。与人脑的同源性使得人脑类器官及类组装体在研究人类神经系统发育异常中具有独特优势，并更加精确地模拟相关疾病表型，促进发病机制解析。
（2）大通量药物筛选。人脑类器官及类组装体的体外培养方式能获得大量样本，满足高通量药物筛选需求，其与人脑组织的高相关性又使得其在药物筛选方面具有高可靠性，有助于新药开发。
（3）精准医疗。人脑类器官及类组装体能够动态模拟人类大脑发育时间进程，这为研究者提供了一个探索不同发育阶段及疾病进程的多功能平台，结合患者hiPSC来源这一特征使其在个体化治疗方面前景广阔。类器官模型的体外培养方式使得包括基因编辑治疗和药物治疗等多种手段方便易施，为神经系统疾病的临床治疗提供了潜在模型基础。
结合新的实验方法，人脑类器官及类组装体技术有可能开发更完善的功能来探索更复杂的生理及病理表型。其中就包括从特定神经元到成熟神经回路的转变，例如复杂细胞形态的发育、突触可塑性乃至更复杂的神经电路集合。但这需要长期培养及方法改进，进一步促进体外分化神经元成熟度，同时人脑类组装体精确构建神经回路也将作为离体大脑研究的一个可靠方法，它可以允许在受控细胞类型和疾病环境中进行轴突引导和连接追踪。结合这些体内外模型，系统性进行人体组织风险变异的大规模基因组研究也将有利于人类对疾病分子发病机制的认识。
但是人脑类器官技术也面临着脑类器官的血管化挑战。即便能够最终靠组装人脑类器官与内皮细胞，使得人脑类器官中生成某些特定的程度的血管样结构，然而真正意义上的脑血管结构与功能仍未在人脑类器官中完整体现，其内部的营养交换及功能代谢也无法与真实大脑相提并论，这使得人脑类器官的体外培养难以长时间维持。而人脑类组装体技术主要使用在于两个或三个不同脑区/组织的相互联系，相较于真实人脑的功能连接网络和脑区复杂性，进一步构建更多脑区类器官及开发更仿真的组装方式，也是人脑类器官和类组装体技术不可忽视的一点。
所以，为了充分理解人类大脑神经系统，研究者需要结合多种实验技术与手段，开发更可靠的人源性模型，从而深入解析人脑发育过程及神经系统结构与功能，进一步阐明由发育异常或其他因素介导的神经系统疾病的发病机制，最终助力临床应用和疾病治疗。
南京医科大学二级教授，博士研究生导师，科技部重点研发专项首席科学家，国家自然科学基金委员会杰出青年科学基金获得者，国家自然科学基金委员会优秀青年科学基金获得者，江苏省杰出青年基金获得者，入选江苏省双创人才、江苏省“333”工程培养对象和六大人才高峰等。在美国威斯康星大学从事5年的人多能干细胞定向分化与再生医学研究，着重利用人脑类器官开展神经疾病及细胞治疗研究。研究成果多次发表在Nature Biotechnology、Nature Communication、Nature Protocol、the Journal of Clinical Investigation、Molecular Psychiatry和EMBO Molecular Medicine等国际权威期刊。
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