科研丨NPJ BIOFILMS MICROBI: 间歇性禁食调节肠道微生物群, 改善肥胖和宿主能量代谢(国人佳作)
本研究不进行实验来分析和验证IF、肠道微生物群和宿主代谢之间的联系机制。
基于已有16S rRNA基因扩增子测序研究，间歇性禁食(intermittent fasting，IF)是一种颇有前景的减肥模式，能调节肠道微生物群。本研究在72名不同体重指数(BMI)的中国受试者中进行了一项为期三周的IF项目，在此期间，无论最初的人体参数和肠道微生物群状态如何，他们的体重平均减轻了3.67 kg，临床参数也有所改善。在干预前后收集受试者粪便样本，并进行鸟枪法宏基因组测序，从头组装得到2934个宏基因组组装基因组(MAGs)。分析根据结果得出，干预后，狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)和多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)显著富集，其相对丰度与肥胖和动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)相关参数呈负相关。干预后，富集的MAGs显示出较高的碳水化合物活性酶(CAZymes)丰富度和多样性，琥珀酸盐生产和谷氨酸发酵相关基因的相对丰度增加。
通讯作者单位：中国食品发酵工业研究院；深圳华大基因研究院；中国医学科学院北京协和医院
研究人员对72名中国成年受试者进行了为期三周的干预研究，在此期间受试者接受了5:2的饮食计划，详见图1a。受试者包括从正常到肥胖的个体(附表1)。在干预开始前和结束后，研究人员测量了参与者的17个临床指标。研究人员发现，受试者肥胖相关临床指标发生显著改善，包括BMI、体重和动脉粥样硬化指数(AI)(图1b、附图1和附表1)。受试者体重平均下降3.67 kg(调整后p 0.0001)，BMI平均下降1.32(调整后p 0.0001)，而AI平均下降1.53(调整后p 0.0001)。这些变化证明了本研究中采用的5:2饮食计划的有效性。
研究结果进一步表明，IF干预引起的临床改善不局限于肥胖受试者，在BMI正常的个体中也具有同样效果。例如，不同BMI水平的参与者在干预后平均体重分别下降了2.82 kg(正常，p 0.0001)、3.84 kg(超重，p 0.0001)和4.82 kg(肥胖，p = 0.0003)，AI也分别下降了1.23 (p 0.0001)、1.50 (p 0.0001)和2.10 (p 0.0001)。大多数测量的临床参数，在肥胖(n = 17)、超重(n = 26)和正常(n = 29)受试者中观察到一致的变化趋势(图1b和附图1)。有必要注意一下的是，干预前基于肠道微生物群分类组成的随机森林分类器在预测特定参与者的BMI、体重或AI改善是否高于或低于中位数方面表现不佳(图1c)，这表明对IF干预的主要反应并不取决于肠道微生物群的基线分类组成，这一结果与一项调查一般热量限制的研究的结果一致。
研究设计和三周IF干预后的临床改善情况。a.本研究的研究设计示意图。在每周非禁食的五天里，晚餐主食是代餐粉，参与者可随意进食(即“正常摄入”)。在两个不连续的禁食日，能量摄入设定在500-600千卡(约为参与者正常摄入量的25%)，由代餐粉和蛋白质棒提供。b.干预后受试者BMI、体重、AI均有显著改善(***代表校正后的p 0.001)，并且这些变化在不同BMI水平的参与者中是一致的。c.干预前基于MAGs相对丰度的随机森林分类器的ROC曲线。曲线下面积(AUC)分别为0.570、0.681、0.582。
为了表征IF干预对肠道微生物群的影响，参与者被要求在干预前后捐献粪便样本。获得72对匹配样本，接着进行鸟枪宏基因组测序。
值得注意的是，大约三分之一的副拟杆菌和拟杆菌MAGs在IF干预后显示出丰度增加，而之前已有研究证明狄氏副拟杆菌和多形拟杆菌对能量代谢和肥胖的发展有有益影响。
IF干预后肠道微生物群分类组成的变化。a.属水平系统发育树，只纳入了在干预前或后具有高丰度的MAGs。外圈的柱状图表示MAGs的倍数变化。洋红色条表示干预后丰度升高，蓝色条表示干预后丰度降低(校正后p 0.05)。该树由PhyloPhlAn (v3.0.51)构建，ggtree (v5.6.2)进行可视化。b.干预前后AMG富集的倍数变化。倍数变化小于0表示IF干预前MAG的丰度高，倍数变化大于0表示干预后MAG丰度高。
然后，研究人员研究了147个MAGs中碳水化合物活性酶的多样性，并在物种水平上进行了分类注释，并分析了干预前后样品之间的丰度差异。IF干预后，碳水化合物活性酶编码基因的种类更多，拷贝数也更高。这些基因大多注释为糖苷水解酶(GHs)和糖基转移酶(GTs)，表明肠道微生物群利用不一样碳源的能力得到增强(图3a)。有必要注意一下的是，拟杆菌属细菌(Bacteroides sp.)主要贡献了多糖裂解酶(PLs)的丰富度，而在其他属的MAGs(特别是在干预前丰度较高的那些MAGs)中鉴定到的PLs编码基因很少。
干预前后高丰度MAGs中碳水化合物活性酶的丰富度和多样性。a.比较在IF干预前后高丰度MAGs中发现的碳水化合物活性酶亚家族数目和碳水化合物活性酶编码基因拷贝数。b. MAGs相对丰度与受试者临床参数之间的关联热图。红色表示正相关，而蓝色表示负相关。AI:动脉粥样硬化指数；ALT：丙氨酸转氨酶；BFR：体脂比；DBP：舒张压：LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；UA：尿酸。c. MAG的丰度与AI呈负相关。倍数变化小于0表示IF干预前MAG高丰度，倍数变化大于0表示IF干预后MAG高丰度。
为了进一步评估肠道菌群的变化是否与受试者的血液生化参数和干预后的临床改善相关，研究人员分析了MAGs相对丰度与宿主临床参数之间的相关性，共发现136个MAGs与至少一种临床参数显著相关(图3b和附表3)。特别是86个MAGs(属于25个细菌种)与AI呈负相关，包括8种多形拟杆菌和17种狄氏副拟杆菌，其中84个MAGs还与血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)呈负相关。
除了分类组成的变化外，研究人员还分析了肠道微生物群功能潜力的变化。研究人员将质控后的clean reads映射到已发表的肠道微生物基因目录中，以计算功能注释基因的丰度。
在满足校正后p 0.01和fold-change 1的阈值下，研究人员发现，IF干预后25个KEGG Orthologues(KOs)显著富集，而16个KOs的相对丰度下降(图4a)。然后，研究人员进一步计算了Reporter Z score以确定功能通路的富集程度。根据结果得出，干预后碳代谢、柠檬酸循环和戊糖磷酸途径明显地增强，这可能会引起肠道微生物群的碳水化合物转化率更高，短链脂肪酸(SCFA)产量增加(图4b)。
研究人员进一步分析了KOs的相对丰度与临床参数的相关性，发现共有220个KOs与至少一项临床参数相关(图4c和附表4)。KOs与血清LDL-C和血清甘油三酯(TG)呈负相关，与血清总胆固醇(TC)、AI和体脂呈负相关，具有高度的一致性。有必要注意一下的是，三个KOs的相对丰度，K00844(己糖激酶)、K06859(葡萄糖-6-磷酸异构酶)和K15037(生物素羧基载体蛋白)，它们在琥珀酸盐的合成中起作用(附图3)，K03146(半胱氨酸依赖性腺苷二磷酸噻唑合酶)，与硫胺素合成有关(附图4)，K05681(ATP结合盒，G亚家族)，参与胆汁分泌(附图5)，在干预后非常明显升高，但与高脂血症和动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)紧密关联的5个参数呈负相关。最后，参与hopene合成的K06045与血清γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)呈正相关，而未鉴定的K08087与血清天冬氨酸转氨酶(AST)呈正相关。
IF干预改变了肠道微生物群的功能潜力。a.在火山图中，每个点代表一个KO，并用颜色进行区分。IF干预前富集的KOs用红色表示，干预后富集的KOs用蓝色表示。b.X轴代表Z值，Y轴代表功能通路。z值0表示通路在干预前富集，z值0表示通路在干预后富集。条形图的黑色程度表示每条通路的完整性。c.KOs相对丰度与临床参数相关性热图。红色代表正相关，蓝色代表负相关。
虽然有研究报道称限时进食(TRF)和隔日IF(ADF)是老年人和肥胖者有效的减肥手段，但还没有详细证据说明这些饮食计划或任何其他饮食计划是否也会对体重和体脂正常的个体产生有益的临床效果。在这项研究中，72名受试者，包括健康正常体重(18.5 kg/m2≤ BMI 24.0 kg/m2)到超重(24.0 kg/m2≤ BMI 28.0 kg/m2)和肥胖(BMI≥28 kg/m2)，坚持了三周5:2IF计划，在非禁食日没有一点额外的体育活动或饮食控制，平均体重减轻了3.67 kg。而且，受试者的临床参数，特别是与肥胖、高脂血症和ASCVD相关的临床参数，也有所改善。此外，与一般热量限制的减肥研究得出的结论相反，干预前肠道微生物群并不影响本研究中IF饮食计划的效果。因此，本研究的根据结果得出，无论受试者肠道微生物群的组成如何，IF干预都可能是一种颇有希望的减肥策略，适用于各种BMI值的人群。
先前的一项小鼠研究表明，肠道微生物群可能有助于间隔一天禁食诱导的白色脂肪组织褐变，并报道了拟杆菌和副拟杆菌的相对丰度同时下降。然而，目前尚不清楚人类和其他IF饮食计划中是否也存在这种相关性。其他的小鼠研究已经分析了不同禁食计划引起的肠道微生物群的变化，但很少报道拟杆菌或副拟杆菌相对丰度的显著变化。较少的人类研究评估了IF诱导的肠道微生物群变化以及与体重减轻和宿主代谢的关系，而且这些研究，只采用了16S rRNA基因扩增子测序方法，并不能完整展现物种基因组水平的全貌。这些研究分别报道了ADF和Ramadan会造成多发性硬化症患者和健康成人中拟杆菌科(Bacteroidaceae)和拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度增加，而其他文章报道的IF诱导的肠道微生物群分类组成的变化并不一致。在本研究中，在IF干预后多种拟杆菌和副拟杆菌物种的相对丰度明显地增加，特别是报道的有益细菌狄氏副拟杆菌和多形拟杆菌。这一变化与之前在小鼠研究中的报道不同，强调了小鼠和人类肠道微生物群之间的差异，表明对IF干预的反应和相关的分子机制可能不同。本研究分析显示，IF干预后高丰度的狄氏副拟杆菌和多形拟杆菌的相对丰度与血清LDL-C和AI之间有显著的负相关关系，这表明这些细菌可能在IF干预的有益效果中发挥作用。有必要注意一下的是，有报道称ASCVD患者中Bacteroides spp.和P. distasonis的相对丰度均下降。
为了进一步研究IF及IF诱导的肠道菌群变化与参与者临床参数改善之间的关系，研究人员研究了肠道菌群功能潜力的变化。通过一系列分析碳水化合物活性酶的丰富度和多样性，发现在IF干预后富集的大多数物种，主要是拟杆菌属和副拟杆菌属物种，编码GHs、GTs和PLs的基因丰富度和多样性非常高，而能够消化各种碳水化合物和糖蛋白的微生物丰度的显著增加可能是IF干预导致碳源间歇性短缺的结果。有必要注意一下的是，拟杆菌属携带大量的PL编码基因，而该家族的基因在其他物种中很少发现，这表明拟杆菌属在对饮食禁食干预的微生物反应中起着特殊的作用。
根据先前的报道，狄氏副拟杆菌的富集可能通过产生琥珀酸和激活肠道糖异生来减轻小鼠的肥胖和代谢功能障碍，而高丰度的多形拟杆菌可能会增加谷氨酸向γ-氨基丁酸(GABA)的转化，以此来降低血浆谷氨酸浓度。同样，在本研究中，观察到干预后与琥珀酸合成和谷氨酸代谢相关的KOs丰度增加，并且这些KOs与肥胖、高脂血症和ASCVD的临床参数呈负相关。物种和功能基因相对丰度的同时增加支持了一种假设，即IF干预可能会引起富含碳水化合物活性酶的肠道细菌的富集，包括狄氏副拟杆菌和多形拟杆菌，这些细菌能通过产生琥珀酸盐和GABA来减轻肥胖和并发症。
由于本研究的最大的目的是研究间歇性禁食怎么样影响肠道微生物群和宿主生理参数，以及这一些因素之间的潜在联系，因此作者采用单组设计，以最大限度地提高坚持间歇性禁食饮食模式的个体数量，这将提高相关性分析在参与者总数限制下的统计效力。然而，由于没有对照组，因此不可能在本研究中对IF和正常饮食模式作比较。虽然在干预后受试者的临床改善明显且具有统计学显著性，表明干预是有效果的，但一些不受控制的协变量也可能在其中作用。要进一步的大规模随机临床试验来验证本研究的结果，并更好地区分IF干预本身引起的效果和参与者没注意到的行为变化。
虽然还要进一步的体外和体内研究来阐明IF、肠道菌群和宿主代谢之间的关系，但本研究的根据结果得出，IF诱导的肠道菌群变化能促进受试者体重减轻和其他相关的临床改善，而不是IF干预直接引起的改善的“副作用”。最后，其他在IF干预后也被富集的细菌，特别是Fusicatenibacter saccharorans的遗传和功能特征尚未得到很好的表征。这些微生物的可能作用值得进一步研究。
近期发表的综述文章总结了关于IF及其对肠道微生物群影响的人体试验。本研究的一个显著优势是，研究人员进行了深度宏基因组测序和从头组装，而不是16S rRNA基因扩增子测序，提供了物种甚至菌株水平的肠道微生物群信息，以及功能潜力方面的信息。基于详细宏基因组数据的关联分析进一步揭示了临床参数与特定肠道微生物之间的相关性。此外，与之前的参与者较少的人体研究相比，本研究的参与者数量相对较多，可以对BMI范围较大的参与者做多元化的分析，并表明无论BMI如何，临床改善的趋势都是一致的。
然而，本研究也存在一些局限性。如上所述，研究中没有对照组，并没医务人员监督严格遵守平常的饮食。尽管参与者记录了所有的食物摄入，并要求在三周的干预期间遵循他们的正常习惯，但未控制的协变量也可能会引起观察到的变化。此外，虽然有报道称血浆动脉粥样硬化指数考虑了TG，可能在预测潜在心血管事件方面有更好的表现，但它是经对数转换的，在具体的回归分析中有极大几率会出现问题。因此，我们使用了AI，由于其简单的优点，许多临床医生仍然在使用AI，而本研究中没用AIP。此外，本研究未测量“肠道转运时间”。由于先前的研究报道了肠道转运时间会影响肠道微生物群的组成，因此IF与肠道微生物群之间的相互作用可能受到该因素的调节。最后，本研究不进行实验来分析和验证IF、肠道微生物群和宿主代谢之间的联系机制。
